qPCR絕對定量與相對定量：原理、應用與選擇策略

前言：




分子生物學研究中，實時定量PCR（qPCR）是強大工具，可精確測量特定DNA序列數量，其定量能力對基因表達分析等領域至關重要，能助我們理解基因表達量及確定病原體數量。

qPCR定量方法分absoiute定量和相對定量，本文將探討其定義、實驗設計、應用場景及實際研究中的選擇應用。




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qPCR的absoLute定量




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定義

absolute定量直接測量目標分子拷貝數，不依賴參照基因表達水平，通過構建標準曲線確定樣本中目標分子absolute數量，適用于需知確切分子表達的情況。

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實驗設計

標準曲線制作：準備與目標分子大小和GC含量相似的 核酸序列作標準品，進行系列稀釋，對各稀釋度標準品進行qPCR反應并記錄Ct值，以濃度對數為橫坐標、Ct值為縱坐標繪制標準曲線，確保線性良好、R2值接近1。



實驗操作步驟：從組織等提取DNA/RNA，配置含DNA/RNA模板等的反應體系，在qPCR儀器上反應并記錄目標基因和標準品Ct值，用標準曲線計算樣本中目標分子absolute拷貝數。



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應用場景

病毒載量測定：在病毒感染研究中，absolute定量可直接測量病毒基因拷貝數估算病毒載量。

基因拷貝數變異分析：在遺傳學研究中，absolute定量能精確測量特定基因拷貝數，助研究人員識別與疾病相關的基因拷貝數變異。




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qPCR的相對定量




（一）、定義

相對定量通過比較目標基因與參照基因表達水平定量，無需知道目標分子sbsolute拷貝數，用內參基因標準化目標基因表達量以消除實驗變異，廣泛用于基因表達分析。 特別是在比較不同樣本或不同條件下基因表達變化的研究中。




（二）、相對定量的實驗設計

內參基因的選擇：選擇合適內參基因是相對定量成功關鍵，其應在所有樣本中穩定表達，不受實驗條件影響。選擇標準為穩定性（表達在不同樣本和條件下保持穩定）、相似的表達水平（與目標基因相似以減少定量誤差）、無干擾（不應與目標基因存在交叉反應）。常用內參基因有管家基因，如β - actin、GAPDH等，在大多數細胞類型中表達穩定。



ΔΔCT方法：是常用相對定量分析方法，通過比較目標基因和內參基因的Ct值計算相對表達量。

計算過程為：先計算ΔCT（目標基因Ct值與內參基因Ct值之差），再選一個樣本作對照組，計算其他樣本與對照組的ΔCT差值得ΔΔCT，最后用2^ - ΔΔCT公式計算相對表達量。



（三）、相對定量的應用場景

基因表達分析：相對定量可助研究人員了解特定基因在不同條件下的表達變化。操作步驟包括樣本收集、RNA提取、cDNA合成、qPCR反應、數據分析（用ΔΔCT方法）。

條件變化下的表達差異分析：相對定量在比較不同條件下基因表達差異中很重要，如藥物處理、疾病狀態等。應用示例有評估藥物分子作用機制（比較藥物處理前后基因表達變化）、尋找潛在生物標志物（分析疾病與正常狀態下基因表達差異）。






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absolute定量與相對定量比較與選擇




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提優缺點比較

sbsolute定量優點：精確性高，能提供目標分子精確拷貝數，適用于需具體數值的研究；直接測量，不依賴內參基因，減少因內參選擇不當帶來的誤差

缺點：操作復雜，需制備和分析標準曲線，增加實驗復雜性和時間成本；成本較高，標準品制備需額外成本和時間。

相對定量優點：操作簡便，不需要制備標準曲線。 優點：簡單，可通過選合適內參基因適應不同實驗條件。

缺點：依賴內參基因，結果準確性取決于其穩定性，表達不穩定會影響結果；相對測量可能因內參選擇不當引入誤差。

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選擇依據

實驗目的：需知目標基因確切拷貝數（如病毒載量測定、基因拷貝數變異分析）選absolute定量；比較不同樣本或條件下基因表達變化（如基因表達分析、條件變化下表達差異分析）選相對定量。

樣本類型和數量：稀有或珍貴樣本，absolute定量更合適，能提供更精確測量；處理大量樣本，相對定量更高效，可簡化實驗流程。

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    Best實踐建議

實驗設計建議：制備標準曲線用與樣本來源相似標準品提高定量準確性；選在實驗條件下表達穩定、無顯著變化的內參基因；至少進行三次重復實驗確保結果可靠、可重復。

數據分析建議：相對定量中對數據適當歸一化處理減少技術變異影響；解釋結果時考慮實驗設計、樣本處理和數據分析各步可能引入的變異；用專業數據分析軟件提高分析準確性和效率。